KANEKA KanCapA♦-Affinitätschromatographiesorbens

Protein A-Sorbens mit hoher Kapazität und hoher Beständigkeit gegen NaOH, das für die Aufreinigung monoklonaler Antikörper entwickelt wurde.

Das KANEKA KanCapA-Chromatographiesorbens ist ein Protein A-Affinitätschromatographiesorbens für die Verwendung im industriellen Maßstab. Dieses langlebige Sorbens besitzt eine hohe dynamische Bindungskapazität und sorgt für eine höhere Gesamtproduktivität der Prozesse zur Verarbeitung monoklonaler Antikörper (mAb). KANEKA KanCapA-Sorbens eignet sich ideal für den Mab-Capture-Schritt und kann bei einem Single Column-Batch-Betrieb oder einem kontinuierlichen Prozess mit einem Mehrsäulen-Chromatographie-System verwendet werden.

• Patentrechtlich geschützter Ligand des rekombinanten Proteins A (rProtein A) mit verbesserter Selektivität
• Hohe Bindungskapazität entsprechend den aktuellen Mab-Expressionsniveaus
• Milde pH-Elution zum Schutz vor Aggregation oder Denaturierung des monoklonalen Antikörpers (Mab)
• Gute NaOH-Stabilität für eine längere Lebensdauer

Beschreibung

KANEKA KanCapA-Sorbens besteht aus einer festen Zellulosematrix, an die der rProtein A-Ligand kovalent gebunden ist, um die Stabilität über mehrere Zyklen sicherzustellen und so eine hohe Flussleistung bei niedrigem Druck zu bieten, und ist daher für die Prozessanforderungen für die Mab-Herstellung in großem Maßstab geeignet.
KANEKA KanCapA-Sorbens ist in verschiedenen Eluentenzusammensetzungen, einschließlich ScreenExpert RoboColumns♦ und PRC-Fertigsäulen, erhältlich, die für eine rasche Optimierung der Methode oder der Vorbereitungsarbeiten im kleinen Maßstab entwickelt wurden. Das Sorbens wird als Großgebinde in Form von Slurry in 20%igem (v/v) Ethanol in verschiedenen Verpackungsgrößen von 25 ml bis 10 l geliefert.

Protein A-Ligand

Das native Protein A besitzt eine hohe Affinität zum Fc-Abschnitt des Immunglobulins, zeigt aber auch eine unerwünschte Affinität zum Fab-Abschnitt. Um die Interaktion zwischen Fab und Protein A zu unterbrechen, ist häufig ein niedriger pH-Wert erforderlich, der aber wiederum zu einer unerwünschten Aggregation des monoklonalen Antikörpers (Mab) führen kann.
Das für das KANEKA KanCapA-Sorbens verwendete Protein A wurde modifiziert und ist ein Pentamer der mutierten C-Domäne des nativen Protein A-Moleküls. Aufgrund der Beständigkeit der C-Domäne gegenüber NaOH besitzt das KANEKA KanCapA-Sorbens eine gute NaOH-Stabilität, benötigt milde Elutionsbedingungen und weist keine nachweisbare Fab-Bindung auf. Das rProtein A wird in Bakterien exprimiert und enthält keine tierischen Anteile.

Abbildung 1
Schematische Darstellung des Aufbaus des neuen Protein A-Liganden von KANEKA

Regulierungsvorschriften

Die technische Dokumentation (Regulatory Support File, RSF) steht unter Einhaltung der Geheimhaltungsvereinbarung zur Verfügung. Der gesamte Produktionsprozess ist frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs und ist zertifiziert BSE-TSE-frei.

^♦ KANEKA KanCapA ist eine Marke der Kaneka Corporation.

Vorteile wie die Waschschritte nach dem Beladen

Protein A-Sorbenzien sind bekannt für ihre Selektivität bezüglich monoklonaler Antikörper (Mab). KANEKA KanCapA-Sorbens reduziert HCP-Rückstände aus dem Eluent und verbessert dadurch die Reinheit der monoklonalen Antikörper (Mab). Wie in Abbildung 7 dargestellt steht der HCP-Gehalt in direktem Zusammenhang mit dem Mab-Feedstock. Durch die zusätzlichen Waschschritte nach dem Beladen, die zum Entfernen von HCP-Rückständen dienen, konnte die Mab-Reinheit während der Elution verbessert werden.

Abbildung 7
Vergleich des Gehalts an Host-Cell Protein (HCP) im Elutionspool, gemessen von HCP ELISA

Waschprotokoll-Nr.	1. Waschen	2. Waschen
#1	Tris, pH-Wert 7	keine
#2	Tris, pH-Wert 7 + 0,15 M NaCl	keine
#3	Tris, pH-Wert 7 + 0,15 M NaCl	Tris, pH-Wert 7
#4	Tris, pH-Wert 7 + 1 M NaCl	Tris, pH-Wert 7

Basismatrix	Hochvernetzte Zellulose
Durchschnittliche Partikelgröße	65 ~ 85 μm
Ligand	Rekombinantes Protein A (alkalibeständig)
Kopplungschemie	Reduktive Aminierung
Dynamische Bindungskapazität1	≥ 35 mg humanes polyklonales IgG/ml gepacktes Sorbens
Chemische Beständigkeit	Stabil in Lösungen, die weitverbreitet bei Affinitätschromatographien verwendet werden
Arbeits-pH-Wertbereich	pH-Wert 2 ~ 13
CIP-Bedingung	0,1 ~ 0,5 M Natriumhydroxid 15 Min. Kontaktdauer
Betriebs-Flussrate	Bis zu 500 cm/h (Betthöhe 20 ~ 25 cm)
Verweildauer	≥ 3 Min. (4 ~ 6 Min. werden empfohlen)

¹ 5 % dynamische Bindungskapazität, ermittelt durch Frontanalyse nach 3 Minuten Verweildauer

Betriebs-Flussraten

KANEKA KanCapA-Sorbens ist vorgepackt und ungepackt für die Verwendung in Säulen im Labor-, Pilot- und Produktionsmaßstab erhältlich und unterstützt hohe Flussraten, die den Anforderungen moderner Produktionsprozesse entsprechen.

In Abbildung 2 ist der Druck im Vergleich zur Flussrate für das KANEKA KanCapA-Sorbens dargestellt. Die Daten wurden mithilfe von Wasser in Säulen mit einem Innendurchmesser von 4,4 cm bis 45 cm ermittelt. Die Betthöhe betrug ca. 20 cm. Bei 500 cm/h beläuft sich der Druckabfall auf 1,5 bar g (22 psi g), was vergleichbar mit den Werten routinemäßig verwendeter Prozesssysteme ist. Die Packleistung ist zuverlässig und für Säulen vom Labor- bis zum großen Maßstab (60 cm ID) skalierbar. Typisch sind Werte von > 4.000 Platten pro Meter (1 % Azetonpuls bei 60 cm/h) und und Asymmetriefaktoren (AF) von 1–1,2.

Abbildung 2
Druck im Vergleich zur Flussrate für Säulen mit einem Innendurchmesser von 4,4 cm bis 45 cm und einer Betthöhe von 20 cm bis 23 cm

Die von den gepackten Betten erzeugten Drücke werden berechnet, indem der Systemdruck vom Gesamtdruck subtrahiert wird.

Hohe Bindungskapazität für Hochtiterverfahren

Mab-Expressionsniveaus sind in den letzten Jahren stetig angestiegen und Titer von > 5 g/l sind heute üblich. Einer der wichtigen Parameter, der sich auf die Gesamtproduktivität von Mab auswirkt, ist die dynamische Bindungskapazität (Abbildung 3). KANEKA KanCapA-Sorbens besitzt eine Kapazität von > 50 g/l bei 6-minütiger Verweildauer und erfüllt somit die Leistungsanforderungen eines führenden Protein A-Chromatographiesorbens. Die dynamischen Bindungskapazitäten für zwei Mab bestätigen die positiven Eigenschaften des Sorbens (Abbildung 4).

Abbildung 3
Verweildauer vs. Dynamische Bindungskapazität (polyklonales humanes IgG)

Abbildung 4
Dynamische Bindungskapazität des KANEKA KanCapA-Sorbens für zwei Mab-Moleküle, die im CHO-Zellkultur-Überstand exprimiert wurden

Herausragende Beständigkeit gegenüber NaOH und somit eine lange Lebensdauer

KANEKA KanCapA-Sorbens kann mit 0,1 oder 0,5 N NaOH gereinigt werden. Es kann für mindestens 200 Zyklen bei regelmäßigem CIP unter Verwendung von 0,1 M NaOH (15-minütige Kontaktdauer) ohne deutlichen Kapazitätsverlust nach 100 Zyklen eingesetzt werden (Abbildung 5). Ein geringes Nachlassen von ~20 % wird nach 300 Zyklen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Bei Bedarf können höhere NaOH-Konzentrationen von bis zu 0,5 M für das regelmäßige CIP des KANEKA KanCapA-Sorbens verwendet werden. Die mehrfache Verwendbarkeit eines Sorbens ist besonders hinsichtlich seines kontinuierlichen Einsatzes bei einer Mehrsäulen-Chromatographie wichtig. Seine NaOH-Beständigkeit macht das KANEKA KanCapA-Sorbens überdies zu einer idealen Lösung für diesen sich neu entwickelnden Bereich des Bioprocessing. Der Verlust von Protein A beträgt < 10 ppm und liegt damit nach ein paar CIP-Zyklen unter der Nachweisgrenze (1 ppm).

Abbildung 5
Untersuchung des Lebenszyklus bei wiederholtem CIP des KANEKA KanCapA-Sorbens mit alkalischem Reiniger



Verbleibende dynamische Bindungskapazität von 5 % nach wiederholtem CIP mit alkalischem Reiniger mit 0,1 M oder 0,5 M NaOH (A); Ausbeute und Auswaschung des Protein A-Liganden in der Zyklusverwendungs-Untersuchung mit 0,1 M NaOH (B).
Dauer des Kontakts mit NaOH bei allen Tests: 15 Minuten.

Milder Elutions-pH

Protein A-Affinitätschromatographiesorbenzien benötigen einen sauren pH-Wert für die Elution gebundener monoklonaler Antikörper (Mab). Die Exposition monoklonaler Antikörper (Mab) mit einem sauren pH-Wert führt jedoch häufig zu Aggregation und Denaturierung, was Auswirkungen auf die Gesamtausbeute des Prozesses hat. Der für KANEKA KanCapA-Sorbenzien verwendete modifizierte rProtein A-Ligand ermöglicht die Elution bei einem milderen pH-Wert von ca. 3,5, während herkömmliche Protein A-Liganden einen pH-Wert von 3,0 oder darunter benötigen. Diese milderen sauren Lösungen können bei verschiedenen monoklonalen Antikörpern (Mab) bei hoher Ausbeute eingesetzt werden (Abbildung 6).

Abbildung 6
Elutions-pH-Wert von fünf monoklonalen Antikörpern (Mab)


Konzentrierung des geladenen Mab: 1 mg/ml Sorbens. Elutions-pH wurde mit einer pH-Gradienten-Untersuchung unter Verwendung von 50 mM Zitrat mit einem pH-Wert von 6 bis 2 ermittelt, 20 Säulenvolumina (SV).

Bestellinformationen

Artikel-Nr.	Beschreibung
26080–026	KANEKA KanCapA 25 ml
26080–035	KANEKA KanCapA 500 ml
26080–058	KANEKA KanCapA 5 l
26080–064	KANEKA KanCapA 10 l
SR2KANCAPA	ScreenExpert RoboColumn KANEKA KanCapA 200 μl, 8er Reihe
SR6KANCAPA	ScreenExpert RoboColumn KANEKA KanCapA 600 μl, 8er Reihe
PRC05X050KANCAPA	PRC-Fertigsäule 5 x 50 KANEKA KanCapA, 1 ml
PRC08X100KANCAPA	PRC-Fertigsäule 8 x 100 KANEKA KanCapA, 5 ml