Gesteigerte Produktivität mit Minimate™ Kapsulen als Ersatz von Rührzellsystemen

Einleitung

Ultrafiltration erhält biologische Aktivität und spart Zeit

Die Technologie zur Aufreinigung von Proteinen hat sich aus verschiedensten Methoden wie chemischer Ausfällung zur Probenkonzentrierung oder Dialyse zum Pufferaustausch zu druckbasierten Tangentialflußsystemen mit Ultrafiltrationsmembranen weiter entwickelt. Die Ultrafiltrationstechnik (UF) setzt auf die Verwendung von Polymermembranen mit präzise definierten Porengrößen, um Moleküle der Größe nach zu separieren. Einfach gesagt basiert das UF-Verfahren auf der Verwendung des Flüssigkeitsdrucks, um die Migration/den Durchfluß kleinerer Moleküle durch die UF-Membran bei gleichzeitiger Rückhaltung größerer Moleküle voranzutreiben.

Obwohl auch die chemische Ausfällung zur Konzentrierung einer Proteinprobe verwendet werden kann, setzt die Separation durch Ultrafiltration auf mechanische statt chemische Wechselwirkungen und ermöglicht es dem Forscher so, eine Probe ohne Zusatz von denaturierenden Lösungsmitteln oder Salzen zu konzentrieren. Ein Pufferaustausch mittels der Dialysetechnologie erfordert große Volumina an Puffer, und da nur Diffusionskräfte auf die Lösung wirken, kann das Verfahren mehrere Tage in Anspruch nehmen. Die vormontierten und einfach anwendbaren Ultrafiltrationseinheiten können entweder Konzentrierungs- oder Pufferaustauschverfahren ohne die umständliche Handhabung, die für viele andere Techniken erforderlich ist, in kurzer Zeit durchführen.

Optimierung der Ultrafiltration durch Cross Flow/Tangentialfluß

Die Ultrafiltration kann in einem von zwei Arten durchgeführt werden: Direktflußfiltration (DFF) oder Tangentialflußfiltration (TFF, Abbildung 1). DFF eignet sich gut für kleine Volumina (bis zu 30 ml) bei Verwendung von Zentrifugeneinheiten. Bei DFF Technologien können jedoch Probleme mit Membran-Fouling auftreten (1). Um die Bildung einer Gelschicht zu reduzieren, kann ein Querstrom auf der Upstream-Seite der Membran erzeugt werden. Dies geschieht entweder mittels eines Rührstäbchens (z.B in einer Rührzelle) oder durch Erzeugung einer kontrollierten laminaren Strömung. Während Rührzellen die UF Leistung verbessern, sind sie hinsichtlich der optimalen
 







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Leistung jedoch eingeschränkt, da die Geschwindigkeit und die daraus folgende Verwirbelung von der Größe, dem Radius und der Geschwindigkeit des Rührstäbchens abhängen.

Abbildung 1

Graphischer Vergleich von DFF gegenüber TFF

(A) Die Probe fließt durch den Feed Kanal (Einlaß) und entlang der Membranoberfläche ebenso wie durch die Membran hindurch. Der Querstrom (Cross Flow) verhindert eine Ablagerung von Molekülen auf der Oberfläche, die zu einem Fouling führen könnten.
(B) Das TFF Verfahren verhindert das schnelle Abfallen der Fließrate, welches sich bei der Direktflußfiltration zeigt und ermöglicht so die Verarbeitung eines größeren Volumens pro Einheit Membranoberfläche.


(A) Der Feed wird in die Membran geleitet. Moleküle, die größer sind als die Poren, sammeln sich auf der Membranoberfläche und bilden ein Gel, das zum Fouling führt und den Strom der Flüssigkeit durch die Membran blockiert.
(B) Bei einem höheren filtrierten Volumen steigt ebenfalls das Fouling an, und die Fließrate fällt schnell ab.

Optimierte Cross Flow Leistung mit der Minimate Kapsule

Im Vergleich zu Rührzellen-Technologien sind TFF-Verfahren reproduzierbar, leicht steuerbar, und überwachungsfreundlich (4). Alles in allem ermöglichen TFF-Verfahren eine einheitliche und schonende Rezirkulation des Probenflusses über die Oberfläche einer Membrane und halten so das Membran-Fouling wirksam unter Kontrolle. Die Nutzung der gesamten Membranoberfläche führt zu einer höheren Fließrate und damit zu einer Reduktion der Prozeßdauer und einer höheren Produktivität. Die Minimate Kapsule ist vormontiert und gebrauchsfertig und kann ohne Eingreifen des Anwenders Volumina von bis zu 1 Liter verarbeiten. Im Gegensatz hierzu verfügen die meisten Rührzellen über ein Verarbeitungsvolumen von 350 ml oder weniger und müssen wiederholt geöffnet werden. Dadurch ensteht das Risiko eines Integritätsverlustes und fordert einen höheren Arbeitsaufwand und größere Aufmerksamkeit. Mit der Minimate Kapsule zeigen sich im Vergleich zu Rührzellen erhebliche Zeiteinsparungen bei der Durchführung eines einfachen Konzentrierungsprotokolls oder eines komplexeren Enzym-Aufreinigungsverfahrens.

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Materialien und Methoden

Minimate TFF Kapsule

Minimate TFF Kapsulen enthalten die Omega™ Ultrafiltrationsmembran (Polyethersulfon), die horizontal in ein geschlossenes System eingebaut ist und die in einer großen Auswahl von Cut Off´s erhältlich ist. Bei Verwendung der Minimate Kapsule können Proben von bis zu 1 Liter mit wenig Aufwand auf bis zu 5 ml konzentriert werden. Die wiederverwendbare oder Einweg-Kapsule kann einzelne oder aufeinanderfolgende Konzentrierungs-/Diafiltrationsschritte mit derselben Einheit in einem geschlossenen Kreislauf durchführen. Eine Vielzahl an Schlauchpumpen kann für TFF-Verfahren verwendet werden.

Minimate Kapsulen Aufbau
Tangentialflußfiltration: Minimate Kapsule, Aufbau

Rührzellen

Handelsübliche Rührzellen wurden gemäß Anleitung des jeweiligen Herstellers montiert, betrieben, und gereinigt. Einer der Hauptunterschiede im Betrieb gegenüber TFF bestand darin, dass ein Druckbehälter oder Stickstofftank zur Erzielung des erforderlichen Drucks benötigt wurde. Zudem erforderten die Rührzellen vom Anwender, die Einheit während des Betriebs zu öffnen, neu zu befüllen und zu re-montieren, wenn eine Diafiltration erforderlich war.

Technische Daten Minimate Rührzelle
Effektive Filterfläche 50 cm2 (0,05 ft2) 28,7 cm2 (0,03 Fuß2)
Empfohlene Cross Flow Rate 40-50 ml/min k. A.
Betriebstemperatur 5-50 °C (41-122 °F) 5-50 °C (41-122 °F)
Maximaler Betriebsdruck: 4 bar (60 psi) 400 kPa 55 psi (N2 oder filtrierte Luft)
Arbeitsvolumen des Systems (Feed/Retentat) 5-10 ml 5-10 ml

Diagramm 1

Minimate TFF Kapsulensystem mit Pumpe, Manometer, Retentat-Klemme, Reservoirbehältern und Schlauchanschlüssen
Minimate TFF Kapsulensystem mit Pumpe, Manometer, Retentat-Klemme, Reservoirbehältern und Schlauchanschlüssen

Einfache Inbetriebnahme mit Minimate Kapsulen

Die einfach verwendbare Minimate Kapsule kann an ein Schlauchpumpensystem angeschlossen werden, um den Querstrom/Cross Flow im Retentatkanal zu erzeugen. Ein detailliertes, vollständiges Protokoll zum Betrieb und zur Feineinstellung der Minimate Kapsule kann dem „Care and Use Guide“ und den weiteren aufgelisteten Veröffentlichungen (2, 3, und 5) entnommen werden. Im Folgenden ein kurzer Überblick zum Betrieb:

Einrichtung
  1. Schließen Sie alle erforderlichen Schläuche an der Kapsule an. Halten Sie hierderen Länge so kurz wie möglich, um das Arbeitsvolumen des Systems zu verringern. Installieren Sie das Manometer am Feedanschluß (Einlaß) der Kapsule.
  2. Kalibrieren Sie die Schlauchpumpe auf die erforderlichen Fließraten.
  3. Halten Sie die Retentatseite der Kapsule leicht erhöht, um die Luftabscheidung zu erleichtern.
  4. Befestigen Sie die Klemme lose am Retentatschlauch.

Verarbeitung
  1. Füllen Sie den Reservoirbehälter mit der zu filtrierenden Lösung und leiten Sie Retentat- und Filtratleitungen zu verschiedenen Behältern. Pumpen Sie die Lösung mit einer Fließrate von 40 ml/min durch die Kapsule.
  2. Nachdem ein Flüssigkeitsvolumen, das ungefähr dem Totvolumen entspricht (10 ml), durch die Retentat- und Filtratleitungen gepumpt wurde, platzieren Sie die Retentatleitung wieder im Reservoirbehälter und platzieren Sie die Filtratleitung in einem eigenen Behälter.
  3. Fahren Sie mit der Verarbeitung fort, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Werden beispielsweise 500 ml an Lösung 5-fach konzentriert, stoppen Sie die Filtration, wenn 100 ml im Reservoirbehälter verbleiben.
  4. Sie können eine Diafiltration durchführen (optional), indem Sie neuen Puffer in den Reservoirbehälter geben (2).
  5. Verwenden Sie eine 15 ml Spritze zur Aufnahme des Retentats, wenn die Volumina unter 10 ml liegen. Drosseln Sie bei der finalen Konzentrierung die Pumpe, um ein Aufschäumen des Produkts zu vermeiden.

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Ergebnisse und Diskussion

Gesteigerte Produktivität mit der Minimate Kapsule

Die Prozeßdauer hängt von der Gesamtleistung der Kapsule ab. Der Betrieb von fünf Minimate 10 kD Omega Kapsulen wurde direkt vergleichen mit der Verwendung von vergleichbaren Rührzellen mit Membranen aus PES oder regenerierter Cellulose unter ähnlichen Betriebsbedingungen. Es wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem 1 Liter von 2 mg/ml BSA um das zehnfache konzentriert wurde (auf 100 ml), um die Unterschiede in der Prozeßdauer zwischen den Konfigurationen zu demonstrieren. Unter diesen Betriebsbedingungen war das Verfahren bei Verwendung der Minimate Kapsule nach etwas mehr als einer Stunde abgeschlossen (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu war die Prozeßdauer bei den Rührzellen unabhängig von der Membrankonfiguration 5 Mal länger. Zusätzlich zu der längeren Prozeßdauer erforderten die Rührzellen zudem noch Eingriffe vom Anwender in Form von wiederholten Befüllungszyklen.

Abbildung 2

Die Verwendung der Minimate Kapsule verringert die Prozeßdauer erheblich
Tangentialflußfiltration: Die Verwendung der Minimate Kapsule verringert die Prozeßdauer erheblich  

Eine 2 mg/ml-BSA Lösung wurde um das 10-fache konzentriert (1000 bis 100 ml), jeweils in einer 350 ml Rührzelle oder einer Minimate Kapsule. Die Minimate Kapsule enthält eine vormontierte Omega 10 kD Membran. Der Cross Flow wurde auf 50 ml/min eingestellt und ein Rückdruck aus dem Retentatkreislauf angelegt, um einen anfänglichen Filtratfluß von etwa 15 ml/min zu erzeugen. Bei den Rührzellen kamen Membranscheiben aus Polyethersulfon (PES) oder regenerierter Cellulose (RC) zum Einsatz. Bei den Zellen wurde mit filtrierter Luft ein Druck von 55 psi angelegt und so ein anfänglicher Filtratfluß von ungefähr 6 ml/min erzeugt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung bei 5 unabhängigen Durchläufen an.

Eine Messung der Absorption bei 260 nm sowohl der Filtrat- als auch Retentatfraktionen verifizierte den Proteinkonzentrierungsprozeß. Bei der Verwendung von Rührzellen wurde eine Leckage von BSA durch die 10 kD PES Membran beobachtet, was wiederum auf ein Integritätsversagen hindeutete. Um einen statistisch signifikanten Vergleich zwischen den Konfigurationen zu ermöglichen, wurden in Folge zusätzliche Experimente durchgeführt, bis insgesamt 5 erfolgreiche Durchläufe mit Rührzellen abgeschlossen waren.

Handhabung und Integrität der Einheit

Ein Integritätsversagen während des Prozesses kann nicht nur zu Zeitverlusten, sondern ebenfalls zur Zerstörung wertvoller Proben führen. Die Minimate Kapsule wird als versiegelte, geschlossene Einheit hergestellt, die keine Montage durch den Endanwender erfordert. Mit TFF kann eine 1 Liter Proteinprobe in einem einzigen Schritt verarbeitet werden, wodurch das Risiko, die Probe zu beschädigen, verringert wird. Im Gegensatz hierzu zeigen die Rührzellen eine komplexe Bauweise, bei der UF Membranscheiben auf einer Basis platziert und festgeschraubt werden. Dabei können Leckagen oder Bypässe entstehen. Größere Leckagen sind leicht durch ungewöhnlich hohe Filtratfließraten erkennbar. Problematischer kann jedoch ein teilweiser Bypass sein, der sich nicht vom Normalbetrieb unterscheidet. Hierbei würde der Proteinverlust nicht erkannt werden bis es zu spät ist oder der Durchlauf beendet ist.

Bei der Überwachung des Filtrats auf Proteinbypässe beobachteten wir, dass die PES Membran des Mitwettbewerbers in Rührzellen erhebliche Integritätsfehler erlitt (Abbildung 3). Die Minimate TFF Kapsulen und Rührzellen mit regenerierter Cellulose erlitten kein Integritätsversagen; die PES Membranen des Mitwettbewerbers versagten bei 5 von 10 Prozessen in verschiedenen Prozeßstufen.

Abbildung 3

Die vormontierte Minimate eliminiert Integritätsversagen
Integrale Minimate TFF und Rührzellen mit regenerierter Cellulose 

Die Probenkonzentrierung wurde wie in Abbildung 2 dargestellt durchgeführt. Aliquots des Ausgangsmaterials, des letztendlichen Retentats und des abschließenden Filtratpools wurden auf Proteinkonzentrationen bei 280 nm analysiert. Die durchschnittlichen Konzentrationen sind eingezeichnet, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung bei jeweils (5 - Minimate), (10 - Rührzelle PES), und (5 - Rührzelle RC) Durchläufen anzeigen. Für eine einfachere graphische Darstellung sind die Retentatwerte auf der Achse Y2 eingezeichnet, um die zehnfache Konzentrierung des Prozesses darstellen zu können.

Aufreinigung von Cyclooxygenase-2 (COX-2)

Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) führte eine Vergleichsstudie zur Validierung der Verwendung der Minimate Kapsule anstelle einer Rührzellen in der Aufreinigung von Schaf-COX-2-Enyzm aus Gewebe-Homogenat durch (Tabelle 1). Das Unternehmen konnte problemlos ein neues Protokoll entwickeln, das die Rührzelle im Enzymherstellungsprozeß ersetzte. Zudem wurde herausgefunden, dass die COX-2-spezifische Aktivität in der TFF Prozedur der Aktivität in der vorher eingesetzten Rührzelle gleichkam. Der wichtigste Faktor bestand jedoch in der Prozeßdauer, die bei der TFF auf nahezu ein Drittel verkürzt wurde und so letztendlich die Durchführung eines zweiten Laufs in einer Schicht ermöglichte.

Cayman COX-2 protocol using both the Pall Ultrasette™ and Minimate devices:
  1. Schaf-Kotyledonen in Puffer homogenisieren.
  2. Homogenat 20 Minuten lang bei 10.000 x g und 4°C zentrifugieren.
  3. Überstand 1 Stunde lang bei 100.000 x g und 4°C ultrazentrifugieren.
  4. Mikrosomales Pellet in Solubilisierungspuffer mit 1% Tween 20 resuspendieren.
  5. Durch Rühren 1 Stunde lang bei 4°C solubilisieren.
  6. 1 Stunde lang bei 100.000 x g und 4°C ultrazentrifugieren.
  7. Concentrate supernatant at 4 °C using a Pall Ultrasette with a 30K MWCO membrane. 300 ml auf 10 ml konzentrieren, daraufhin mit DE-53 Säulenpuffer auf 100 ml verdünnen.
  8. Probe in DE-53 Anionenaustauschersäule laden, waschen und Enzym mit einem pH-Gradienten eluieren.
  9. Eluent mit einer Minimate Kapsule oder einer Rührzelle mit einer 30 kD Membran konzentrieren. 350 ml auf 6 ml konzentrieren, daraufhin Membran mit 3 ml Puffer waschen.
  10. Konzentrat zur finalen Verarbeitung in Sephadex G-200 Trennsäule laden.

Tabelle 1

Vergleichsprüfung mit Cyclooxygenase-2

Unabhängige Aufreinigung Rührzelle 1 Rührzelle 2 Rührzelle 3 Minimate 1 Minimate 2 Minimate 3
Anfängliche Protein-Konz. (mg/ml) 15,0 14,5 15,0 13,6 14,1 14,7
Anfängliche spezifische Aktivität (U/mg) 66,7 62,1 70,9 73,5 67,4 74,8
Konzen-
trierungsfaktor
50 46 50 40 44 41
Finale spezifische Aktivität 220 196 191 200 217 206
Finale Ausbeute (SA/mg Gesamtprotein) 0,048 0,045 0,043 0,042 0,044 0,040
Prozeßdauer (Stunden) 8,0 8,0 8,0 2,5 2,5 2,5

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Schlussfolgerungen

Das anwenderfreundliche Minimate TFF System stellt die schnellste und zuverlässigste Wahl zum Pufferaustausch oder zur Konzentrierung von Proben von bis zu 1 Liter dar. Die geschlossenen TFF Kapsulen können gereinigt und wiederverwendet werden, wodurch Zeit bei der Inbetriebnahme und im Betrieb eingespart wird (5). Im Gegensatz hierzu erfordern Rührzellen eine Montage, weisen längere Prozeßdauern auf, benötigen intensivere Überwachung und müssen mehrfach wiederbefüllt werden, um Probenvolumina von bis zu 1 Liter zu verarbeiten. In dieser Arbeit beobachteten wir, dass die Minimate Kapsule eine 1 Liter Proteinlösung um das Fünffache schneller konzentrieren konnte als ein vergleichbares Rührzellensystem. Diese Beobachtung wurde durch eine unabhängige Untersuchung für die Aufreinigung des Cyclooxygenase-2-Enzyms bestätigt; in diesem Fall wurde die Prozeßdauer um das Dreifache verringert, ohne dass es zu einem Verlust an Proteinaktivität kam.

Während die Minimate TFF Kapsule ein wertvolles Werkzeug für kleine Prozeßvolumina (< 1 Liter) darstellt, können größere Volumina durch ein Multiplexverfahren mit mehreren Minimate TFF Kapsulen in Parallelanordnung verarbeitet werden. Darüber hinaus sind die Minimate TFF Kapsulen mit derselben Fließ-Weg-Länge wie die größeren TFF Einheiten konzipiert, wodurch bei der Skalierung vom Labormaßstab auf Pilot- und Prozeßmaßstab wertvolle Optimierungszeit gespart werden kann.

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Literatur

  1. L. Schwartz und K. Seeley, 2002. Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications. Pall Scientific & Technical Report, PN 33213.
  2. L. Schwartz, 2003. Diafiltration: A Fast, Efficient Method for Desalting or Buffer Exchange of Biological Samples. Pall Scientific & Technical Report, PN 33289.
  3. L. Schwartz, 2003. Desalting and Buffer Exchange by Dialysis, Gel Filtration or Diafiltration. Pall Scientific & Technical Report, PN 33290.
  4. J. Jenco, T. Hu, L. Schwartz, and K. Seeley, The partnership of the Minimate TFF Capsule with Liquid Chromatography Systems Facilitates Lab-Scale Purifications and Process Development Through In-Line Monitoring Technical Report.
  5. Minimate Care and Use Manual, nur in elektronischer Form, auf CD-ROM in Minimate TFF-Produktverpackung.