Ionenaustauschchromatographie

Durch die Ionenaustauschchromatographie werden Verbindungen basierend auf der Nettooberflächenladung separiert. Moleküle werden entweder als Anionen (mit negativer Ladung) oder Kationen (mit positiver Ladung) eingestuft. Einige Moleküle (z. B. Proteine) können sowohl über anionische als auch über kationische Gruppen verfügen. Ein positiv geladener Träger (Anionenaustauscher) bindet eine Verbindung mit einer insgesamt negativen Ladung. Umgekehrtt bindet ein negativ geladener Träger (Kationenaustauscher) eine Verbindung mit einer insgesamt positiven Ladung.

Ionenaustausch-Matrizen können des Weiteren in stark oder schwach unterteilt werden. Starke Ionenaustausch-Matrizen sind über ein breites pH-Wert-Spektrum geladen (ionisiert). Schwache Ionenaustausch-Matrizen sind innerhalb eines kleineren pH-Wert-Spektrums ionisiert. Die vier üblichsten Ionenaustausch-Typen werden hier gezeigt:

Tabelle für die Produktauswahl

 

Art des Ionen-
austauschers

Typische Abkürzung

Funktionelle Gruppe

Pall-Produkt

Stark anionisch Q Quar-
täres
Ammonium
Schwach anionisch DEAE Diethyl-aminoethyl
Stark kationisch S Sulfon-
säure
Schwach kationisch CM Carboxymethyl
 
  Chromatographie

Produkte für die Chromatographie

Chromatographie Anwendungen
Affinitätschromatographie
Entfernung von Detergentien
HCIC
Hydroxyapatit Chromatographie
Ionenaustauschchromatographie
Größenausschlusschromatographie

Auswahlhilfe Chromatographie (Selection Guide)

Chromatographiesäulen

Pall empfohlene Online Labor Community

Pall offers ion exchange resins, pre-packed columns, and membranes. In vielen Bereichen stellen Chromatographiesorbentien das Medium der Wahl für Chromatographie-Anwendungen dar. In einigen Fällen, in denen sorbentienbasierte Methoden Beschränkungen unterliegen (z.B. Aufreinigung von Viren oder großen Molekülen) haben sich Membranen als robuste, skalierbare, und wirtschaftliche Alternative bewiesen. Membranen weisen bei solchen Anwendungen aufgrund ihrer höheren Fliessraten im Vergleich zu Sorbentien eine gute Leistung auf.

Welche Fliessrate ist anzuwenden?

Mustang Membran-Chromatographie-Einheiten sind auf den Betrieb mit Fliessraten von mindestens 10 Säulenvolumina pro Minute ausgelegt. Die Optimierung von Pufferlösung, pH-Wert, Kapazität und Elutionsbedingungen kann bei dieser Fliessrate erfolgen. Höhere Fliessraten für die Äquilibrierung, Ladung und Reinigung sorgen für einen höheren Durchsatz. Eine geringere Fliessrate während des Bindungs- und Elutionsschrittes kann bei einigen Prozessen eine bessere Auflösung bringen. Die offene Struktur von Mustang Membranen erfordert keine Diffusion in die Poren, wodurch in der Regel hohe Fliessraten ermöglicht werden.

Welcher Puffer ist zu verwenden?

Üblicherweise sind Ionenaustausch-Chromatographie-Medien in Puffer geringer Ionenstärke geladen. Unter diesen Bedingungen werden geladene Makromoleküle von der stationären Phase mit entgegengesetzter Ladung abgeschieden. Makromoleküle mit der gleichen Ladung wie die stationäre Phase fließen dagegen einfach ohne Bindung hindurch. Die Ionenaustausch-Matrix wird mit einem zusätzlichen Puffer geringer Ionenstärke gereinigt, um alle verbliebenen ungebundenen Spezies vollständig auszuwaschen, und die gebundenen Spezies werden von Puffern mit ansteigendem Salzgehalt differentiell eluiert. Mit ansteigender Ionenstärke der mobilen Phase konkurrieren die Salzionen um die Bindung an die Ladungen auf der Ionenaustausch-Matrix, und lösen die gebundenen Makromoleküle ab und ermöglichen ihnen von der Matrix zu eluieren. Um Schwierigkeiten zu vermeiden, verwenden Sie anionische (negativ geladene) Puffer zum Kationenaustausch (Mustang S-Membran), und kationische (positiv geladene) Puffer zum Anionenaustausch (Mustang Q-Membran).

Welcher pH-Wert ist zu verwenden?

Obwohl der pH-Wert die Ladung einer starken Ionenaustausch-Matrix nicht beeinflusst, beeinflusst er die Ladung auf den Makromolekülen in der Lösung. Der Betriebs-pH in der Ionenaustausch-Chromatographie wird so gewählt, dass die Auflösung des Zielmoleküls gegenüber dem Verunreinigungs-Background maximiert wird. In einigen Fällen wird ein pH-Wert ausgewählt, der für eine maximale Bindung des Zielmoleküls und eine minimale Bindung der Verunreinigungen (positiver Modus) sorgt. Die Elution des Zielmoleküls erfolgt durch eine Erhöhung der Salzkonzentration. In anderen Fällen wird ein pH-Wert ausgewählt, der für eine maximale Bindung der Verunreinigungen und eine minimale Bindung des Zielmoleküls (negativer Modus) sorgt. Das Zielmolekül fließt hindurch, während die Verunreinigungen aufgrund ihrer Bindung an die Matrix separiert werden. Durch sorgfältige Auswahl sowohl der Ionenaustauschmatrix als auch des Betriebs-pH-Wertes können sowohl Ausbeute als auch Reinheit eines Schrittes maximiert werden. Allerdings ist es unmöglich 100 %ige Reinheit in einem einzigen Schritt zu erzielen, weshalb mehrere Schritte nacheinander erfolgen müssen, um die Vielfalt chemischer Unterschiede zwischen Zielmolekül und den Verunreinigungen zu nutzen.

Welches Salz ist für die Elution zu verwenden?

Nach der Bindung werden die Salzkonzentrationen für die Elution ausgewählt, und zwar so, dass das Zielmolekül nicht zusammen mit den Verunreinigungen eluiert wird, die ebenfalls an die Ionenaustausch-Matrix gebunden haben. Ionen des Salzes für die Elution müssen andere Moleküle der Ladungsgruppen der stationären Phase entweder schrittweise oder in einem Schritt zwischen 0 und 1,0 M ablösen.

Verdrängungseffektivität gebräuchlicher Kationen: Ca2+ > Mg2+ > Na+ > K+ >NH4+

Reihenfolge der Verdrängungseffektivität gebräuchlicher Anionen: PO43- > SO42- > COO- > Cl-

Diese Angaben korrelieren mit der Hofmeister-Reihe, und die stärkste Elutionssalzkonzentration ist nicht immer die Beste. Ideal wäre es, mehrere Salze zu testen, und die Bestimmung optimaler Elutionsbedingungen ist häufig mit Versuchen und Fehlschlägen verbunden. Die meisten Anwender beginnen mit NaCl oder KCl – einfach, weil sie in jedem Labor zur Verfügung stehen. CaCl2 oder MgCl2 können ebenfalls verwendet werden. Bei einigen Proteinen stellen diese Salze letztlich tatsächlich die bessere Wahl dar. Doch egal, welches Elutionssalz letztlich verwendet wurde: der Effekt auf Reinheit, Stabilität und Aktivität des Zielmoleküls muss beurteilt werden.